DSY5000X熒光顯微鏡 DSY5000X熒光顯微鏡 第五節(jié) 熒光顯微鏡（Fluorescence microscope） 熒光顯微鏡是用人眼不可見的一定波長的紫外線作光源照射被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生人眼可見的熒光，然后再經(jīng)顯微鏡成象系統(tǒng)放大來進(jìn)行鏡檢。熒光顯微術(shù)是生物、醫(yī)學(xué)中的重要研究工具，如對(duì)生物組織、生理、病理、微生物、醫(yī)藥、食品、化學(xué)等諸方面的鑒定等。 一、基本原理 （一）熒光：普通光是由發(fā)光體質(zhì)點(diǎn)的熱運(yùn)動(dòng)所引起的幅射；而熒光是非溫度幅射，是一種冷光。熒光有多種，如光化熒光（由光源激發(fā)而產(chǎn)生的熒光）、放射熒光（由放射性物質(zhì)激發(fā)而產(chǎn)生的熒光）、生物熒光（生物體發(fā)出的熒光）、化學(xué)熒光（如磷的氧化時(shí)發(fā)出的熒光）等等。而熒光顯微鏡則是利用“光化熒光”這一原理設(shè)計(jì)制造，達(dá)到熒光顯微術(shù)鏡檢的目的。 由于熒光顯微鏡的光源是利用人眼不可見的短波光——紫外線，因而就大為提高了物鏡的分辨率，圖象與背景的反差亦甚為明顯。 （二）熒光現(xiàn)象：將熒光物體放到光譜中的各色區(qū)域，就可艱現(xiàn)引起熒光有效的光線是光譜上波長較短的區(qū)域，即近紫外線區(qū)域，波長約0.32~0.40um。這種現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是分子吸收了短波光的能量（波長越短，光能越強(qiáng)），又以發(fā)光的形式以波長較長的熒光射出，而為人眼可見，這就是“熒光現(xiàn)象”。熒光接近可見光的紅端，大部分的熒光現(xiàn)象是符合這一規(guī)律的。熒光現(xiàn)象可分為兩種： 1）一次熒光現(xiàn)象：又稱“固有熒光”或“自發(fā)熒光”，當(dāng)經(jīng)紫外線的照射后，就能發(fā)出熒光的物質(zhì)而謂之； 2）第二次熒光現(xiàn)象：又稱“繼發(fā)熒光“，當(dāng)經(jīng)紫外線照射后不能或只部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光素處理，再經(jīng)紫外線照射才能發(fā)生熒光，這是因組織內(nèi)吸附或溶解有熒光素的緣故。 熒光色素的種類甚多，大部分為制片技術(shù)中所用的染色劑，對(duì)各種被檢物體表現(xiàn)出不同的親和性。因此，對(duì)熒光色素的選擇、應(yīng)用濃度及處理時(shí)間等諸方面都需摸索和積累經(jīng)驗(yàn)。 二、熒光顯微鏡的裝置 熒光顯微鏡在裝置上的重要部件就是要有能提供充分的特定波長的光源裝置，使被檢物體得到理想的激發(fā)而發(fā)出強(qiáng)的熒光。為達(dá)到這一要求，均借助濾光片把激發(fā)的光譜限定在這一特定的波長區(qū)域內(nèi)，而把伴隨發(fā)出的可見光全部吸收或反射掉。此外，為了提高熒光鏡檢的效果，對(duì)聚光鏡（透射式用）、載玻片、蓋玻片和物鏡均有一定的要求。 熒光顯微鏡的裝置有透射擊式和落射式兩種類型。 （一）透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗場(chǎng)聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視場(chǎng)背景。透射式不適用于非透明的被檢物體。 （二）落射工：新型 的熒光顯微鏡多為落射式，在光路中具有分光鏡，光源來自被檢物體的上方，故對(duì)透明與非透明的被檢物體都適用。由于物鏡起到了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場(chǎng)的均勻照明，但它在低倍情況下則暗，而高倍則明。 三、激發(fā)濾色鏡的選擇與熒光色至少的應(yīng)用 生物體的各種組織、不同的細(xì)胞、細(xì)胞器、微生物、病毒等等，對(duì)激發(fā)光的選擇是很重要的，這可利用不同的激發(fā)濾色鏡來達(dá)到佳的激發(fā)光源。在熒光色素的應(yīng)用上也如此，必須應(yīng)用適合某種被檢物體的熒光素，才以獲得滿意的觀察效果。現(xiàn)將一些應(yīng)用實(shí)例列表于下，僅供參考： 激發(fā)方法 | 激發(fā)光主波長 | 應(yīng)用范圍 | UV激發(fā) | 334mu | 一般病理、細(xì)菌FITC（異硫氰熒光素）染色 | 365mu | 自發(fā)熒光觀察，一般熒光抗體法觀察 | V激發(fā) | 405mu | 鄰苯二酚胺、5-羥基色胺等的觀察 | 435mu | 四環(huán)素染色：牙齒和骨質(zhì)的觀察研究 | B激發(fā) | 405、435和490mu | 熒光抗體法（EITC）：名疫學(xué) | 附近的連續(xù)光譜 | 吖啶橙（黃）染色：癌細(xì)胞、細(xì)血球、蛔蟲等的觀查 金色胺染色：染色體的觀察研究 喹吖因染色：染色體的觀察研究 | G激發(fā) | 546mu | 孚爾根染色：細(xì)胞內(nèi)DNA的研究 |
注：U激發(fā)-紫外激發(fā) V激發(fā)-紫色激發(fā) B激發(fā)-藍(lán)色激發(fā) G激發(fā)-綠色激發(fā) 3）蛋白粘貼劑不能用以熒光色素處理的材料，因蛋白能為熒光色素染色，而發(fā)生附加熒光。 4）如為石蠟制片，脫蠟必須*，因石蠟有青色熒光，切片進(jìn)入水后，應(yīng)充分水洗，再經(jīng)熒光色素處理，用水封固進(jìn)行鏡檢。 5）載玻片、蓋玻片好為螢石玻璃制成，如為普通玻璃，要色澤潔白，厚度要符合標(biāo)準(zhǔn)。同是不能有灰塵及有機(jī)物質(zhì)否則將會(huì)發(fā)生熒光而干擾政黨的鏡檢效果。 6）不能用加拿大樹膠作封固劑，因其本身具有青黃色熒光，可用甘油、甘油膠、糖漿及阿拉伯樹膠封固。 |
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